体外克隆目的基因的方法

　　相邻片段的体外克隆目的基因法：

　　（1）PanhandlePCR法：

　　在限制酶消化的DNA3’端加一个与未知序列上游已知序列互补的单链引物，从而使经变性后产生的单链DNA分子内聚合，导致己知DNA定位于未知相邻DNA侧翼区段。引物设计是该技术运用的关键所在，所需引物包含-一个与已知序列上游互补的单链引物和两对位于该单链引物两侧与己知序列一-致的引物。

　　（2）CassettePCR法：

　　利用Cassette及Casette引物特异性快速扩增cDNA及基因组DNA未知区域的一种有效方法。由于Cassette的5’端没有磷酸基，在目标DNA的3’端和Cassette的5’端的连接部位形成缺口，在第一次PCR反应的第一循环时，从引物C1开始的延伸反应在连接部位终止，从而控制了非特异性的扩增。只有从引物S1开始延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行DNA的扩增反应。再用内侧引物(引物C2，引物S2)进一步进行第二次PCR反应时，能高效特异性地扩增目的DNA。

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